Ozyme

Les bonnes pratiques pour réussir vos transfections d’ADN
Pourquoi j’observe de la toxicité quand je transfecte de l’ADN ?

Transfection ADN – comment éviter la toxicité cellulaire
Pour réduire la toxicité, je vais décrire les bonnes pratiques à suivre en fonction :


Comment préparez-vous les cellules à transfecter ?

Pour optimiser les résultats, il est nécessaire de redéfinir les conditions pour chaque nouvelle lignée cellulaire, puisque chaque type cellulaire peut répondre différemment à un même agent de transfection.

La santé des cellules :
Les cellules doivent être activement en division avant l’étape de transfection, passées régulièrement dans du milieu de croissance frais, supplémenté selon les besoins du type cellulaire (sérum, facteurs de croissance ...). Le nombre de passages des cellules doit aussi être pris en considération :
Dans le cas de cellules fraichement décongelées, il est recommandé d’attendre 2 passages avant la transfection pour que les cellules aient eu le temps de récupérer
Il est déconseillé d’utiliser des cellules ayant subi plus de 20 passages, car le risque est une différentiation non voulue caractérisée par des changements morphologiques, des vitesses de croissance modifiées et probablement une production protéique et une plus faible réponse aux stimuli. De manière générale, les cellules activement en division sont plus réceptives à l’introduction d’ADN étranger que des cellules quiescentes.

 

La densité cellulaire 

  • Une densité cellulaire trop élevée peut provoquer une inhibition de contact, conduisant à une mauvaise absorption d'acides nucléiques et / ou une diminution de l'expression du gène transfecté.
  • Une densité trop faible de cellules peut entraîner une mauvaise croissance, sans contact entre les cellules. Dans ce cas, l'augmentation du nombre de cellules en culture améliore l'efficacité de la transfection.

Idéalement la confluence des cellules doit être comprise entre 60 et 80% et leur viabilité supérieure à 95% au moment de la transfection.

 

Quel type de transfectant utilisez-vous ?

La toxicité des transfectants lipidiques s'explique par leur nature chimique : les lipides, permettent la pénétration des acides nucléiques dans la cellule car ils fusionnent avec la membrane cellulaire (constituée d’une bicouche lipidique) et la création de pores dans la membrane. L’ouverture de ces pores permet à différents composés non souhaités, comme les antibiotiques, de pénétrer dans la cellule, créant de la toxicité.

Les composés de type polymériques comme le jetPRIME®, pénètrent dans la cellule par endocytose,mécanisme beaucoup plus naturel, et sont relargués de façon douce dans le cytosol. Ces deux aspects du mécanisme de transfection limitent la cytotoxicité.

 

Comment préparez-vous votre ADN ?

Les ADN plasmidiques utilisés doivent être hautement purifiés. Le ratio Absorbance 260 / Absorbance 280 doit être compris entre 1,7 et 1,9.
Un faible taux d’endotoxines est nécessaire pour éviter les réponses cellulaires fortuites, comme de la cytotoxicité ou la production de cytokines pro-inflammatoires.
Pendant la préparation de l’ADN plasmidique, ces endotoxines (ou lipopolysaccharides, LPS), composants de la membrane cellulaire des bactéries Gram-négatives (E.coli) sont libérées durant l’étape de lyse des bactéries et souvent co-purifiées avec l’ADN plasmidique. La présence d’endotoxines dans l’ADN plasmidique peut réduire drastiquement les efficacités de transfection, en particulier pour les cellules primaires et les lignées cellulaires particulièrement sensibles. Dans le cas de cellules sensibles aux endotoxines (cellules primaires, cellules en suspension et cellules hématopoïétiques) ou pour augmenter l’efficacité de la transfection et limiter la cytotoxicité, il est recommandé d’utiliser des kits tels que ZymoPURE™ Plasmid pour obtenir de l’ADN de haute qualité, exempt d’ARN ou de protéine.
Il est cependant conseillé de toujours vérifier l’absence de contamination ARN par électrophorèse sur gel d’agarose et coloration au bromure d’éthidium. Les ADN préparés doivent être dilués dans de l’eau stérile ou du tampon TE, puis aliquotés et conservés à -20°C pour éviter les cycles de congélation/décongélation.

 

Quelle quantité d’ADN utilisez-vous ?

Il est nécessaire d’optimiser la quantité d’ADN par rapport au nombre de cellules utilisées.
Pour une transfection plus efficace, il est possible d’augmenter la quantité d’ADN transfectée.
Attention, trop d’ADN transfecté peut réduire l’expression protéique et impacter négativement sur la survie et la physiologie des cellules. On parle alors d’effet cytotoxique sur la cellule. Il faut trouver le meilleur rapport quantité de cellules/ADN. Ces ratios diffèrent en fonction du type de transfectant et du type cellulaire transfecté. Les nouveaux transfectants comme le jetPRIME® ont été développés pour travailler avec de faibles quantités d'ADN.
Nous recommandons toujours de travailler avec la plus faible quantité d'acides nucléiques possible car sur-transfecter la cellule va augmenter la toxicité cellulaire.

Recommandations spécifiques de l’utilisation du jetPRIME® pour la transfection des cellules HEK-293 et HeLa :
jetPRIME® étant très efficace pour la transfection d'ADN sur ces 2 types cellulaires, il est possible d’observer une trop forte expression du transgène lorsque l’on suit le protocole classique, délétère pour les cellules. Par conséquent, nous vous recommandons de diminuer la quantité d'ADN par 2 par rapport au protocole classique (de 1 µg à 0,5 µg par puits pour une plaque 6 puits par exemple), et en utilisant un ratio ADN/ jetPRIME® de 2 :1 c'est-à-dire 2 µl de réactif jetPRIME®pour 1 µg d’ADN.

Pour doser avec précision votre ADN, nous recommandons l’utilisation du spectrophotomètre NanoDROP™ pour obtenir des informations quantitatives et qualitatives de votre échantillon d’ADN avant transfection.

Quelle quantité de transfectant utilisez-vous ?

Il est nécessaire d’optimiser la quantité de transfectant : pour ce faire, testez différents ratios quantité d’ADN / quantité de transfectant. Il est possible de faire varier le ratio quantité d’ADN / quantité de transfectant en fonction du type cellulaire. Il est cependant recommandé de ne pas trop augmenter cette quantité car cela peut s’avérer toxique. Une quantité insuffisante de complexe ADN / transfectant peut entrainer entrainer une sous-expression.

 

Quel protocole suivez-vous ?

Pour réduire la toxicité cellulaire, il s'agit non seulement de bien choisir son agent de transfection, mais également de suivre un protocole adapté à son type cellulaire et de trouver les conditions optimales.


Suivez le
protocole fourni avec le réactif de transfection
Certains réactifs sont inhibés par le sérum ou les antibiotiques, tandis que d'autres, comme le jetPRIME®, peuvent être utilisés dans un milieu contenant du sérum et des antibiotiques, réduisant ainsi les risques de toxicité et le nombre d'étapes du protocole. Vérifiez la confluence cellulaire recommandée, ainsi que la quantité d'ADN et le volume de réactif recommandés.

Respectez le temps d’incubation ADN et transfectant :
Il est recommandé de suivre le protocole fourni avec l'agent de transfection. Ce temps varie généralement entre 5 et 30 minutes et dépend de la nature des agents de transfection.

Optimisez la quantité de complexe ADN / transfectant appliquée aux cellules :

  • - Si la quantité de complexe ajoutée aux cellules est trop faible : le niveau d’expression protéique est faible.
  • - Si trop de complexe est déposé sur les cellules : l’expression peut diminuer en raison d’effets cytotoxiques par exemple.

La dose optimale de complexe ajoutée aux cellules doit être déterminée expérimentalement pour chaque lignée cellulaire.

Le mode d’application du complexe ADN / transfectant sur les cellules est important.
Il y a deux possibilités pour ajouter le complexe de transfection aux cellules :

  • - Soit le mélange ADN / transfectant est distribué goutte à goutte dans le milieu
  • - Ou bien, il est pré-dilué dans le milieu avant de le déposer sur les cellules.

La 1ère option est plus pratique et la seconde évite que des doses toxiques soient appliquées localement sur les cellules.

Le changement de milieu après la transfection est nécessaire pour les transfectants non compatibles avec le sérum.
Certains réactifs de transfection nécessitent que le milieu soit changé quelques heures après la période de capture du complexe ADN / transfectant. Cette étape est cruciale si la transfection doit être réalisée en l’absence de sérum.
Avec des transfectants non toxiques, qui fonctionnent en présence de sérum, cette étape de lavage peut être éliminée.

 

Informations complémentaires sur le jetPRIME®

Vidéo : comment utiliser le jetPRIME ?

Note d’application jetPRIME® – CRISPR

Publications jetPRIME® – CRISPR (transfection de plasmide)
Le jetPRIME® optimal pour la transfection des vecteurs en "Genome Editing" car il est efficace et adapté à la co-transfection de plusieurs plasmides. De plus, il requiert de faibles quantités d’ADN et préserve la viabilité cellulaire.
- Davidson et al., (2014) Genes Dev 28 (4) : 342-56
- Moore et al., (2014) Nucleic Acids Res pii : gku 1326
- Shi, J., et al. (2014), Nature 514, 187-9

Publications jetPRIME® – transfection ADN

 

Si vous avez d’autres questions sur la transfection, contactez-moi