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Purification des Plasmides
FAQ3 – Comment améliorer la pureté des plasmides ?

comment augmenter le rendement et la pureté des plasmides ?
Après la purification, les plasmides peuvent être contaminés par :
  • les tampons
  • les ADN génomiques
  • les ARN
  • et les endotoxines.

Les contaminations par les ADN génomiques ou par les ARN peuvent influencer la fidélité et l'efficacité des applications comme la transformation, le clonage, la PCR ... Les endotoxines sont néfastes pour la transfection en particulier si l'on travaille avec des cellules délicates ou pour des applications in vivo.
Comment éviter ces contaminations et augmenter la pureté des plasmides ?

Sommaire

Comment éviter la contamination par les tampons ?

Il faut s’assurer que la neutralisation est complète. Pour cela, vous pouvez contrôler le changement de couleur si des tampons colorés sont utilisés (ex. les kits ZymoPURE II Plasmid.

Si besoin, aprés l’ajout du tampon 3, re-mélanger 2 ou 3 fois par inversion.

Il faut également s’assurer qu’aucun liquide ne soit à la surface de la matrice de purification. Si les colonnes de centrifugation sont utilisées, il est conseillé de centrifuger une fois de plus pour éliminer complètement les tampons.
Les colonnes ZymoSPIN™ dans les kits ZymoPURE II Plasmid permettent d’éliminer totalement les tampons grâce au nouveau design issu de la technologie ZymoSPIN™.
Découvrez cette technologie en vidéo

 

Comment éviter la contamination par des ADN génomiques ?

Les contaminations par des ADN génomiques sont généralement liées à des manipulations excessives pendant les étapes de lyse et de neutralisation. Les ADN génomiques risquent d’être fragmentés puis relargués. Voici les bonnes pratiques conseillées :
  • Après l’ajout du tampon P2, mélanger doucement en retournant 10 – 12 fois le tube. Il possible de retourner 2 – 3 trois supplémentaires si nécessaire. Eviter le Vortex.
  • N’incuber pas plus de 5 minutes le mélange de tampon P2 et de suspension de cellules
  • Après l’ajout du tampon P3, mélanger doucement en retournant 5 – 8 fois supplémentaires le tube ou après le changement de couleur si un tampon coloré est utilisé (ex. pour les kits ZymoPURE II Plasmid, retouner le tube après que le mélange devient jaune). Eviter le Vortex.
  • Eviter d’utiliser les cultures en saturation ou pas fraîches/pas récentes qui contiennent davantage d’ADN génomiques.

Pourquoi mon plasmide est contaminé par les ARN et comment l’éviter ?

Ceci s’explique par une digestion inefficace de la RNase A. Comment faire pour éviter ce problème :
  • Vérifier que la RNase A est bien incluse dans le tampon P1.
  • Conserver le tampon P1 incluant la RNase A à +4°C.
  • Si le tampon P1 avec la RNase A a été conservé pendant plus de 6 mois, il est conseillé d’y ajouter à nouveau de la RNase A.

Quand ai-je besoin de plasmides exempt d’endotoxine ?

Les endotoxines sont des toxines de nature lipopolysaccharidique (LPS) et thermostables, situées dans la membrane externe de certaines bactéries à Gram négatif (ex. E. coli). Elles sont libérées lors de la lyse des bactéries et co-purifiées avec l’ADN plasmidique.

La présence d’endotoxines dans l’ADN plasmidique peut réduire drastiquement les efficacités de transfection, en particulier pour les cellules primaires, les cellules en suspension ou les cellules sensibles (ex. les cellules hématopoïétiques). Il est recommandé d’utiliser des kits commerciaux pour obtenir de l’ADN exempt d’endotoxine pour les transfections de cellules sensibles ou les transfections in vivo ; pour augmenter l’efficacité de la transfection ou limiter la cytotoxicité. Les kits ZymoPURE II Plasmid permettent d’éliminer très efficacement les endotoxines grâce à l’Endozero Spin-Column. Le niveau d’endotoxines est inférieur à 0,025 EU/µg d’ADN dans les plasmides purifiés avec ces kits (cf. le schéma ci-dessous). Ce niveau est bien inférieur au seuil d’endotoxines autorisé par le FDA pour les vaccins.

 

le niveau d’endotoxines des plasmides purifiés avec les kits ZymoPURE II est inférieur au seuil maximal autorisé par le FDA pour le vaccin.

J'ai besoin de plasmides surenroulés. Quelle est la méthode recommandée ?

Nous recommandons le kit ZymoPURE qui permettent d’obtenir des plasmides surenroulés. En effet la transformation est plus efficace avec des plasmides en forme surenroulée qui sont repris plus efficacement par les cellules. Les plasmides purifiés avec les kits ZymoPURE sont majoritairement en forme surenroulée comme le montre la photo de gel d’électrophorèse ci-dessous.

les plasmides purifiés par les kits ZymoPURE sont en forme surenroulée
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