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Les milieux de culture cellulaire sans sérum

La majorité de la culture cellulaire en recherche se fait aujourd’hui en milieux classiques contenant du sérum et développés empiriquement depuis les années 50-60. La bioproduction utilise déjà et couramment des milieux sans sérum. Et, de nombreux biologistes cellulaires montrent un intérêt croissant pour éviter l’utilisation de sérum.
Sommaire

Qu’est- ce qu’un milieu sans sérum ?

Les milieux de culture cellulaire classiques pour la culture in vitro ont été développés empiriquement pour reproduire les conditions de vie des cellules in vivo. Ils contiennent : 
  • Une source de carbone (glucose et/ou L-glutamine)
  • Des acides aminés essentiels
  • Des sels minéraux
  • Des vitamines
  • Un tampon pour stabiliser le pH
  • Un colorant, le phénol red pour contrôler l’acidification du milieu
Ils sont supplémentés couramment par 5 à 10% de sérum de veau fœtal (FBS en anglais). Ce sérum est un cocktail de facteurs (principalement de protéines (40-80 mg/ml), de minéraux, de lipides et d'hormones) 
  • Permettant l’attachement cellulaire (fibronectine), la croissance et la prolifération in vitro
  • Protégeant également des forces de cisaillement en bioréacteurs (viscosité)
  • Agissant comme transporteur (« carrier ») des lipides, des minéraux, des globulines (l’albumine et la fétuine), du fer (la transferrine) et des facteurs de croissance
  • Adsorbant les composés toxiques
- Les milieux sans sérum 
Les milieux sans sérum sont préparés sans ajout de sérum animal mais peuvent contenir des constituants ou substituts du sérum, tels que des composants d’origine animale ou des protéines.

- Les milieux sans sérum et sans composant d’origine animale 
Les milieux sans constituant d’origine animale sont similaires aux milieux sans sérum sauf qu’ils contiennent des composants d’origine non-animale : c'est-à-dire des protéines recombinantes remplacent les protéines natives, et les nutriments sont obtenus à partir de sources synthétiques, végétales ou microbiennes 
  • Si les sources sont synthétiques, ils sont dits chimiquement définis (« CD »)
  • Un milieu, qui contient un hydrolysat de plantes, n’est pas considéré comme chimiquement défini, et est dépourvu de composants d’origine animale (« AO/NAO »: animal origin/non animal origin).
- Les milieux sans sérum et sans protéine 
À l’inverse, les milieux sans protéines (« protein-free ») sont par définition totalement dépourvus de protéines. En pratique, ils contiennent une faible teneur en petites protéines (ex. insuline recombinante humaine de 5 kDa), voire de peptides (MW inférieure à 10 KDa).

Ces 3 types de milieux peuvent être classés selon leur complexité progressive : 
  • Les milieux sans sérum ont la composition la plus complexe et peuvent être utilisés de manière universelle pour la culture de lignées cellulaires mammifères et, sont donc les plus adaptés pour la grande majorité des applications en recherche.
  • Les milieux sans produit d’origine animale ou sans protéine sont moins complexes et ont une composition plus définie. Mais leur utilisation est limitée à la culture de certaines lignées bien spécifiques adaptée à la production de protéines à visée thérapeutique car ils sont dépourvus d’éventuels contaminants (protéines, micro-organismes, toxines).
L’absence de sérum écarte une source de variabilité venant des lots de sérums qui doivent être validés et réservés régulièrement.

Il convient donc de choisir son milieu sans sérum en fonction de son application (type de lignée et contraintes réglementaires).

Avantages et inconvénients

Les milieux sans sérum ont 4 avantages principaux sur les milieux classiques (avec sérum) :

- Une composition plus simple et mieux définie
Un environnement cellulaire mieux contrôlé entraîne moins de variabilité pouvant impacter la physiologie de la cellule ; reproductibilité des résultats accrue entre équipes. Les études sur le développement de drogues, la physiologie et l’expression de gènes sont simplifiées. En effet, les composants du sérum sont connus pour fixer, dégrader ou interférer avec les réactifs ajoutés au milieu (ex. trypsine et antibiotiques). L’absence de sérum permet d’éliminer cette possible source d’interférence.

- Une diminution des contaminants (protéines du sérum) pour la production et purification de protéines
Les milieux avec sérum contiennent de 6 200 à 10 000 mg/l de protéines. Une protéine recombinante surproduite en cellule mammifère est produite autour de quelques mg/l à 1 000 mg/l. Pour une protéine endogène, ce niveau d’accumulation est souvent plus faible. Les protéines du sérum sont donc les contaminants principaux de la protéine d’intérêt dans un lysat cellulaire. La purification de cette protéine devient compliquée et génère alors des rendements faibles entrainant un surcoût important de production.
Les milieux sans sérum contiennent une concentration de protéines entre 50 mg/l et 1 000 mg/l. D’autre part, contrairement au sérum, la nature de ces protéines est connue, il s'agit de 4 protéines majoritaires (80 à 90% des protéines totales)  albumine, transferrine, insuline et fétuine. La purification est donc simplifiée car réduction des contaminants et du nombre d’étapes permettant des rendements plus élevés.

- Élimination des sources potentielles d’agents infectieux (bactéries, mycoplasmes, virus, levures, ESB)
Cela permet d’abaisser les coûts pour la bioproduction haut-débit. Ce risque de contamination potentiel est généralement levé grâce aux contrôles qualité des fournisseurs de sérum, mais n’élimine pas l’étape essentielle de validation des lots de sérum.

- Gain de temps  plus de difficulté d’approvisionnement en sérum et plus de validation des lots de sérum
La source principale de sérum au monde est le sérum de veau fœtal. La composition de ce sérum varie énormément en fonction de sa provenance. Certains sérums contiennent des quantités non négligeables d’antibiotiques car utilisés dans les élevages (très dommageable lors de l’utilisation de systèmes d’expression inductibles utilisant la tetracycline/doxycycline ).
L’obligation de validation des lots de sérum est une perte de temps et d’argent. La demande croissante de sérum depuis le développement intensif de la culture cellulaire aboutit à une rareté relative du sérum sur le marché, entraînant une difficulté d’approvisionnement et, cela est concomitant à une diminution du nombre de producteurs dans le monde. En effet, des perspectives éthiques en terme de protection animale font que les fabricants se tournent davantage vers les milieux sans sérum. De plus, la demande croissante d’une meilleure traçabilité des lots de sérum complique notablement son approvisionnement.

Bien qu’il y ait de nombreux avantages aux milieux sans sérum, il existe quelques inconvénients :

- La transition d’un milieu classique avec sérum à un milieu sans sérum nécessite des optimisations et une période d’adaptation 
Pour cultiver une lignée en milieu sans sérum, des tests sont nécessaires et passent habituellement par une diminution progressive de la quantité de sérum. Certaines lignées nécessitent l’ajout de facteurs de croissance spécifiques pour conserver leurs caractéristiques physiologiques.

- Les milieux sans sérum ne contiennent pas assez de protéines pour protéger les cellules des forces de cisaillement (viscosité du milieu) (notamment en bioréacteurs en culture liquide) 
L’addition de suppléments tels que Pluronic F68, PEG sont donc nécessaires (modifiant parfois la capacité des cellules à être transfectées). Les fabricants de milieux incluent déjà ces suppléments dans les formulations de milieux sans sérum pour la culture en suspension.

- L’adhésion des cellules peut être perturbée 
En effet, l’adhésion des lignées cellulaires adhérentes nécessite la présence de matrice extracellulaire à la surface des boîtes dont une partie est habituellement fournie par le sérum (fibronectine). Ces boîtes doivent donc être pré-traitées avec de la fibronectine, laminine, Matrigel™ ou iMatrix-511, ou autre dans le cas d’une culture sans sérum pour permettre une bonne adhésion des cellules. Des milieux sans sérum développés spécifiquement pour la culture de lignées cellulaires adhérentes en condition adhérente ou en suspension ont ainsi été créés (complémentés ou non pour favoriser l’adhérence cellulaire).

- Les cultures en milieu sans sérum peuvent être plus sensibles à des réactifs toxiques pour la cellule 
En effet certains composants du sérum adsorbent ou inhibent habituellement ces réactifs toxiques. Les cultures en milieu sans sérum présentent une sensibilité accrue aux antibiotiques, à la trypsine (présence d’un inhibiteur de la trypsine dans le sérum  alpha2-macroglobuline).

Choisir son milieu sans sérum

Il convient donc de choisir son milieu sans sérum en fonction de son application (type de lignée et contraintes réglementaires).

Pour la culture cellulaire classique avec ou sans production de protéines (but recherche) sans contrainte liée à la bioproduction (lignées spécifiques en conditions particulières) ou réglementaires (protéines à visée thérapeutique) :

- UltraMEM™ : milieu chimiquement défini (CD) permettant de diminuer l’ajout de sérum
Il permet la croissance et l’adhésion d’un large panel de cellules en présence de 2 à 4% de sérum, au lieu des 10% habituels en milieu classique pour des performances équivalentes. L'UltraMEM™ existe sans protéine (avec sélénium) ou à teneur limitée en protéines [insuline, transferrine, éthanolamine (précurseurs des lipides), sélénium (sels minéraux essentiels) (ITES) et L-Glutamine].
Certains facteurs de croissance sont d’ailleurs disponibles séparément pour supplémenter les milieux sans sérum  ITES (insuline, transferrine, éthanolamine, sélénium) et ITS (insuline, transferrine, sélénium).

- Xerumfree™ : substitut au sérum à rajouter au milieu classique (DMEM, RPMI ou autre…) 
Utilisable sur tout type de cellules. L’utilisation d’un substitut de sérum est souvent moins facile à mettre en œuvre qu’un milieu sans sérum complet prêt à l’emploi, car il devra être complémenté par des hormones et facteurs de croissance.

- UltraCulture™ & PC-1™ : milieu sans sérum à large spectre, prêt à l’emploi et utilisable pour la majorité des lignées cellulaires en dehors de la bioproduction 
Il remplace les milieux classiques avec sérum, est supplémenté en protéines d’origine animale (natives) pour palier l’absence de sérum (insuline, transferrine..). Il peut nécessiter parfois l’ajout de suppléments pour conserver les caractéristiques physiologiques des cellules (facteurs de croissance spécifiques).

Pour la bioproduction avec ou sans contraintes réglementaires (protéines à visée thérapeutique), il existe un large panel de milieux sans sérum prêts à l’emploi et dédiés à la culture de types cellulaires spécifiques. Ils ont été supplémentés en protéines matricielles (fibronectine ou laminine) pour permettre une bonne adhérence et croissance, éviter les forces de cisaillement et maintenir la physiologie de la cellule. Aucune optimisation du milieu n'est nécessaire.

Certains contiennent des protéines recombinantes à la place des natives (insuline & transferrine recombinantes humaines produites chez la bactérie) ou sont totalement dépourvus de produits d’origine animale pour des besoins réglementaires.

Guide d’achat à consulter : large choix de milieux optimisés pour la culture d’hybridome (production d’anticorps), la production de protéines en cellules CHO (adhérentes ou en suspension), pour cellules sanguines, pour la cytogénétique (IVD)….
Guide d'achat pour les milieux sans sérum

Comment adapter vos cellules à un milieu sans sérum ?

Pour réussir l’adaptation de ses cellules à un milieu sans sérum, il faut attentivement contrôler le maintien des caractéristiques physiologiques de la cellule comme l’adhérence, la croissance, l’absence de dérive (différenciation particulière), caryotype et aménager certaines conditions liées à l’absence de sérum : 
  • Diminution progressive de la quantité de sérum
  • Modification de l’étape de détachement des cellules adhérentes en présence de trypsine
  • Éviter d’utiliser un antibiotique avec effet cytotoxique (choisir l’antibiotique et la concentration adéquate)
  • Adapter le protocole pour permettre l’adhérence des cellules
Protocole pour adapter vos cellules d’un milieu classique à un milieu sans sérum.
Il est généralement recommandé de suivre un protocole dans lequel on diminue progressivement la quantité de sérum

Par ailleurs, il ne faut pas ensemencer avec une quantité trop faible de cellules lors de l’adaptation. En effet, les facteurs autocrines et paracrines (facteurs de croissances et cytokines) sécrétés par les cellules sont indispensables au contrôle de l’attachement, de la croissance et de la prolifération et sont absents du milieu frais sans sérum. Une densité d’ensemencement supérieure permet d’induire une production immédiate et rapide de ces facteurs. L’ajout de milieu conditionné permet de conserver ces facteurs (ancien milieu contenant des facteurs autocrines indispensables, stérilisé par filtration et conservé à +4°C ).

Protocoles de détachement des cellules par la trypsine adaptés aux milieux sans sérum
En général, on recommande pour les milieux sans sérum un protocole doux car le sérum contient naturellement un inhibiteur de la trypsine (alpha2-macroglobuline et des facteurs d’attachement/adhérence cellulaire (fibronectine).
Après repiquage des cellules adhérentes, il faut veiller à :

- Inhiber efficacement l’activité des protéases (trypsine) par addition d’inhibiteurs de protéases dans le milieu de culture 
  • Inhibiteur de trypsine de la graine de soja (pour trypsine recombinante Trypzean, ou tryplE)
  • Aprotinine 0.1 ml/ml pour trypsine purifiée de pancréas (spectre plus large)
- Diminuer la température pendant l’étape de détachement des cellules par la trypsine
Un protocole « à froid » permet de ralentir l’activité de la tryspine naturelle. Ce protocole utilise de la trypsine-EDTA classique, du tampon Ultra Saline A et un inhibiteur de trypsine de la graine de soja. L’avantage du tampon UltraSaline A par rapport au DPBS est qu’il contient de l’HEPES et du glucose, qui ont un effet positif sur le maintien de la viabilité.

Lire le protocole « à froid »

Lire le manuel d’utilisation du tampon Ultra Saline A

- Remplacer la trypsine naturelle purifiée de pancréas de porc par des enzymes plus douces 
Lire le guide du DPBS

Il est reconnu que la trypsine recombinante est plus douce car plus pure. Elle  ne contient pas de trace d’autres protéases (chymotrypsine…) issues de l’organe d’origine. En effet, en l’absence de sérum, la trypsine naturelle décape complètement les membranes de ses récepteurs qui sont essentiels à la cellule pour répondre aux stimuli de croissance et de prolifération.
Précautions pour l’utilisation d’antibiotiques
En présence de sérum, l’albumine adsorbe la plupart des molécules d’antibiotiques du milieu de culture (jusqu’à 90% pour les pénicillines par exemple). En l’absence de sérum, la majorité des molécules d’antibiotique sont actives et deviennent rapidement toxiques pour la cellule. C’est particulièrement vrai pour la streptomycine qui a la capacité de pénétrer dans le compartiment intracellulaire des cellules et d'interfèrer sur la synthèse protéique. Une même concentration d’antibiotique dans un milieu avec sérum et dans un milieu sans sérum n’a pas les mêmes effets sur la croissance cellulaire. De manière générale, il est conseillé de diminuer la concentration d’antibiotique (pénicilline/streptomycine) ou d'éviter son utilisation ou alors de choisir un antibiotique à large spectre, moins cytotoxique comme la gentamycine (à utiliser à 50 mg/l).
Lire le guide

Certains milieux sans sérum sont déjà supplémentés en albumine pour contourner ce problème.

Amélioration de l’adhésion cellulaire
Il peut être utile d’ajouter des protéines matricielles directement dans le milieu (fibronectine à 25-50 µg/ml ou laminine à 1-5 µg/ml) ou de pré-traiter à la fibronectine, laminine, poly-L-lysine, Matrigel™(lame basale solubilisée) ou iMatrix-511 (fragment de la laminine-511 E8 recombinante) les boîtes de culture pour permettre une adhérence optimale dans le cas de milieux non supplémentés en protéines matricielles (fibronectine ou laminine).


En complément de toutes ces recommandations, notre Service Technique Ozyme est à votre disposition (01 34 60 60 24 - tech@ozyme.fr) pour répondre à vos questions.